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質粒DNA提取不管小提大提都離不開它

發布時間:2020-12-9 17:48:12      點擊:

  離心機在質粒DNA提取中有著很重要的地位,而且操作流程複雜。

  因為質粒DNA作為基因重組與基因轉移的載體,在遺傳工程研究中很重要。

  所以在日常的細胞實驗中經常會用到質粒DNA,現在都用劑盒非常方便,而且菌體培養後,可以多管濃縮提取,提到的質粒量多,可以-20℃保存,以後用於酶切、轉化等實驗,可以提前跑個膠,隻要不降解,就可以繼續用,避免每次要用,都要培養一遍再提取一遍。

TGL-16M-新.jpg

  質粒DNA常見的提取方式分為兩種:

  一.質粒小提

  將之前準備的LB液體培養基中加入抗性(氨苄1:1000),取15ml 離心管,加入5ml 已加入抗性的液體培養基。

  用小白Tips從平板中挑選單克隆,將小槍頭打入15ml 離心管中,30℃,180rpm,搖 >5h,以看到液體培養基變渾濁為準。

  取幹淨的1.5ml EP管,從15ml 離心管中吸取1.5ml(這個量可根據菌液混濁程度加減)菌液,離心機12000rpm,離心3min。

  棄上清,加入250ul TIANGEN質粒小提Kits(Cat# DP103-03,Lot# 6123)P1液,震蕩,徹底混勻。

  加入250ul P2液,溫和(以免DNA斷裂)翻轉6-8次,使菌體充分裂解。(這一步總時間不要超過5min,防止過度裂解,質粒受到破壞)

  向EP管中加入350ul P3液,立即溫和上下翻轉6-8次,充分混勻,此時可看到白色絮狀沉澱,離心機12000rpm,離心3min。(P3加入後應立即混勻,避免產生局部沉澱,若上清中還有微小白色沉澱,可再次離心後取上清)

  將吸附柱CP3(實驗前用平衡液BL處理吸附柱可最大限度激活矽基質膜,提高得率;BL處理過的吸附柱最好當天使用,放置時間過長會影響效果)放在收集管中,將上清轉移到吸附柱CP3中,盡量不要吸到沉澱,離心機12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。

  可選步驟:向CP3中加入500ul去蛋白液PD,12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。(如果宿主菌是end A+ 宿主菌TG1、BL21、HB101、JM係列、ET12567等,因其含有大量核酸酶,所以推薦此步驟;若為end A- 宿主菌DH5α、TOP10等,可省略此步)

  向CP3中加入600ul 漂洗液PW(已加入無水乙醇),12000rpm,離心30-60s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放入收集管。

  重複步驟9。

  離心機12000rpm,離心2min,目的是將吸附柱中殘餘的漂洗液去掉。

  將CP3吸附柱放入一個幹淨的1.5ml EP管中,向吸附膜的中間部位滴加50-100ul洗脫液EB,室溫放置2min,12000rpm,離心2min,將質粒溶液收集到EP管中。(為增加質粒得率,可將溶液再次加入吸附柱CP3,室溫放置2min,12000rpm,離心2min,將質粒溶液收集到EP管中;也可以提前65-70℃預熱EB液)

  測濃度,跑膠看提取質粒的質量。

  二.質粒大提,操作這一步前一般要質粒小提確認質粒的質量。

  取潔淨的錐形瓶,加入小提步驟1中的LB液體培養基100ml,取小提步驟2中的菌液10ul 加入錐形瓶中,30℃,180rpm,搖過夜,以看到液體培養基變渾濁為準。

  保存菌種:用15%的甘油保存菌種:1.5ml EP管中加入350ul 菌液+150ul 50%甘,混勻,-80℃保存。

  將錐形瓶中剩下的菌液用50ml 離心管,4℃,8000rpm,離心5min,收集菌體沉澱,可同管多次。

  根據所選大提試劑盒的說明書按步驟提取,不同試劑盒步驟不一樣。

  提取結束後測濃度,跑膠(因質粒分子量一般較大,所以用低濃度的瓊脂糖膠和大的marker)

  以上就是關於離心機在質粒DNA提取中的應用總結,如果您還想了解更多有關產品的應用信息,可多多關注j9九遊會。


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