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免疫沉澱沒有它無法實現

發布時間:2021-1-4 17:17:46      點擊:

  今天要來講講離心機在免疫沉澱方麵得重要性。

  據了解染色質免疫沉澱簡稱ChIP用來研究DNA上的特定蛋白質。

  而RNA免疫沉澱法(RIP)和ChIP相近,但RNA免疫沉澱法是用來研究會與RNA結合的蛋白質(RNA Binding ProteinImmunoprecipitation,RNA結合蛋白免疫沉澱),是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術,利用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,通過離心機分離純化,對結合在複合物上的RNA 進行RT-PCR驗證或測序分析,了解轉錄後調控網絡動態過程,是研究轉錄後調控網絡動態過程的有力工具,能幫助j9九遊會發現miRNA的調節靶點。

  RIP這種新興的技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白複合物沉澱下來,然後經過分離純化就可以對結合在複合物上的RNA進行分析。RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉澱ChIP技術的類似應用,但由於研究對象是RNA-蛋白複合物而不是DNA-蛋白複合物,RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同(如複合物不需要固定,RIP反應體係中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶,抗體需經RIP實驗驗證等等)。

  RIP技術下遊結合microarray技術被稱為RIP-Chip,幫助j9九遊會更高通量地了解癌症以及其它疾病整體水平的RNA變化,結合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定。

  免疫沉澱是利用抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合後,再與蛋白A/G(ProteinA/G)或二抗偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育,通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白複合物,沉澱經過洗滌後,重懸於電泳上樣緩衝液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,通過離心機離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

  免疫共沉澱是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法,是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

  免疫共沉澱實驗大致流程為:收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉澱誘餌蛋白—SDS-PAGE 分離蛋白—WB 檢測是否存在靶蛋白。

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  操作步驟

  1.一般起步使用2個10cm2皿,用預冷的PBS洗滌細胞三次,最後一次吸幹PBS;

  2.加入細胞裂解液(western及IP裂解液)裂解細胞,使蛋白終濃度在1-7mg/ml;

  3.4°離心10min,去除細胞碎片;注意這裏需要用到冷凍離心機,因為溫度上有嚴格要求。

  4.根據樣品量加入0.5-2ug左右抗體,4℃,旋轉過夜。

  5.取10-30ul protein A/G 的beads於EP管中,棄上清,使用PBS洗滌beads一次。

  6.將樣品加入EP管,4度垂直混勻2-3h。(在吸取瓊脂糖珠的時候,注意要搖勻管子,讓珠子和溶液混合均勻,同時黃槍頭要減掉頭子再吸取,以免破壞珠子),PBS洗脫;4度離心,棄上清,

  7.洗脫三次,酌情用PBS/PBST/高鹽溶液洗瓊脂糖珠,最後一次吸幹洗滌液。

  8.將適量相應抗體的多肽或0.1M PH2.8的甘氨酸稀釋到細胞裂解液中,混勻,取適量於beads中進行洗脫,去除輕重鏈。若用甘氨酸HCL,樣品需要用NaOH中和,根據C1V1=C2V2計算加入NaOH的含量。

  9.通過離心機離心取上清,製樣,跑膠。

  以上就是關於離心機在免疫沉澱方麵得講解,現在您知道“免疫沉澱沒有它無法實現”中得"它"說的是什麽了吧!


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